水稻U-Box蛋白质在不同发育时期的表达分析

摘要：    真核生物基因组中广泛存在U-Box基因,其编码蛋白大部分是泛素系统中决定底物特异性识别的E3蛋白,其构象与RING-finger极其相似.U-Box蛋白质能促进底物蛋向泛素化降解,对细胞内异常蛋白的降解及质量摔制方面发挥着重要的作用.水稻基因组中有77个U-Box蛋白质,系统了解它们的表达可为功能研究提供数据.制备针对水稻U-Box蛋白质的抗体,了解水稻中U-Box蛋白质在不同发育时期的表达信息,为功能研究积累数据.选取了4个水稻U-Box蛋白质,其共同结构特点为U-Box结构在N端,C端有ARM结构.用计算机软件预测抗原决定簇,细菌体系体外表达、纯化U-Box蛋白质的片段,免疫动物制备多克隆抗体,用Western  blotting检测U-Box蛋白质在水稻品种93-11苗期地上部和地下部、分蘖期根和茎、孕穗期剑叶和幼穗、开花期剑叶和穗子、成熟期剑叶和种子中的表达,并与EST数据库中公布的U-Box蛋白质EST数据进行了比较分析.体外克隆表达后,获得了纯化的蛋白质,制备的抗体特异性强,蛋白质印迹(Western  blotting)检测可见一条明显的主带,其中Os06g01304和Os12g38210两个蛋白质的表观分子质量与预测分子质量相符,Os01g66130和Os08g01900两个蛋白质的表观分子质量低于预测分子质量.4个U-Box蛋白质在水稻生长发育的不同时期或部位基本上是组成型表达,且表达量接近.对NCBI上公布的来自274个文库100万条以上的EST进行分析,可以看出4个U-Box蛋白质EST的数量分布大致均匀,与Western  blotting结果揭示的组成型表达平行,与ATPase、HSP81-3、EGF-1  alpha和RuBisCo等对照基因相比,U-Box基因的EST数目相对很少,说明它们属于低丰度转录的基因.选取了4个水稻U-Box蛋白质,通过抗原决定簇预测,表达片段蛋白,制备了特异性抗体,证明了这一技术路线的可行性.利用抗体对水稻不同发育时期材料进行蛋白质表达谱研究,发现这些U-Box蛋白质呈组成型表达,与EST数据揭示的结果具有平行性.所制备的抗体也为相关功能研究,如免疫共沉淀、ChIP-on-chip、Pull-down以及在抗病、抗逆反应中U-Box蛋白质的表达等,积累了资源.